Polyphenol  phytochemicals  have  been  extensively  studied  and  are  the  most  well-known  bioactive  compounds  found  in  plants.  Polyphenols  are  secondary  metabolites  found  in  higher  plants  that  contain  one  or  more  phenol  units  [1].  They  have  strong  antioxidant  activity,  and  can  scavenge  a  variety  of  free  radicals  including  reactive  oxygen  species  (ROS)  and  reactive  nitrogen  species  (RNS)  [2].  Previous  studies  have  shown  the  protective  action  of  polyphenols  on  human  health  and  indicate  their  potential  use  as  key  components  of  a  healthy  and  balanced  diet  [3].  Currently,  the  use  of  natural  antioxidants  in  cosmetics  is  of  increasing  interest.  Previous  studies  show  that  oxidative  stress,  is  the  major  cause  of  skin  ageing  and  is  an  over  production  of  ROS  and  a  reduction  of  antioxidant  activity  with  age  [4].  Moreover,  plant  polyphenols  have  been  reported  to  be  used  as  sunscreens,  whitening  and  anti-ageing  agents  in  cosmetic  products  [5].

The mango (Mangifera indica L)  fruit  belongs  to  the  Anacardiaceae  family  and  is  a  good  source  of  various  polyphenols,  which  are  found  in  the  pulp,  peel  and  seed  [6].  The  mango  fruit  and  its  processed  products  are  in  increasing  demand  in  the  world  market.  Consequently,    mango  seed  and  peel,  which  account  for  35 - 60 %  of  the  fruit  depending  on  the  variety,  are  the  main  by-products  [7].  There are  several  mango  varieties  grown  in  Thailand. The  most  well-known  cultivars  are  Choke-Anan,  Ok-Long,  Kaew,  Nam-Dorkmai,  Rad  and  Keow-Savoey.  The  Choke-Anan  and  Kaew  cultivars  are  commonly  used  for  processing  in  factories,  and  represent  for  29.5 %  and  27.9 %,  respectively,  for  all  mango  varieties.  It  has  been  reported  that  industrial  mango  seed  waste  generation  is  as  high  as  1  ton  annually  [8]. 

The  bioactive  compounds  in  the  mango  seed  kernel  are  tannin,  gallic  acid,  coumarin,  cafeic  acid,  vanillin,  mangiferin,  ferulicacid  and  cinamic  acid  [9].  Mango  seed  kernel  extracts  have  been  reported  to  have  anti-tyrosinase,  anti-inflammatory  and  hepatoprotective  activities  [10].  Therefore,  mango  seed  kernels  could  be  a  potential  source  of  ingredients  for  functional  foods  and  cosmetics  [11].

The  present  study  aimed  to  determine  a  suitable  ultrasonication  time  for  the  extraction  of  two  cultivars  of  Thai  mango  seed  kernel.  The  bioactivity,  antioxidant  activity  and  the  effect  on  tyrosinase,  5-lipoxyganase,  hyaluronidase  and  α-glucosidase  activities  were  also  studied.  The  application  of  the  mango  seed  kernel  extract  in  a  cosmetic  cream  was  evaluated.

Plant materials

Two mango  cultivars  (Mangifera indica  L.)  were studied.  The cultivars,  Kaew  and  Choke-Anan  were  obtained  from  a  local  orchard  in  Nakornratchasima  Province,  Thailand  between  March  and  May,  2015.  Mature green  mangoes  were  selected  by  weight  (200 - 250 g / kg).  The  peel  and  pulp  were  removed  from  the  fruits  using  a  fruit  peeler  and  a  knife,  and  the  seeds  were  kept  at  -18 °C   (Ultra  Cold  Freezer  -80 °C,  CTL  821,  Thailand)  for  no  longer  than  1  month.  Before  use,  the  frozen  kernels  were  separated  from  their  shell  with  scissors.

Preparation of mango seed kernel extract (MSKE)

Crude  MSKE  were  prepared  by  ultrasonic-assisted  extraction  as  previously  described  [12].  All  of  the  samples  were  ground  and  blended  with  95 %  ethanol  (100  ml)  in  a  blender  for  5  min.  The  samples  were  incubated  in  a  sonication  water  bath,  at  a  frequency  of  20  KHz  and  a  temperature  of  25 °C    for  15 - 60  min.  The  samples  were  further  incubated  in  a  water  bath  at  80 °C  and  stirred  every  10  min  for  1  h.  The  mixtures  were  cooled  at  room  temperature  and  the  supernatant  from  each  mixture  was  passed  through  Whatman  filter  paper  no. 4.  All  filtrates  were  evaporated  in  a  rotary  evaporator  at  50 °C  under  a  vacuum  until  dry,  and  the  extracts  were  weighed  to  determine  the  extraction  yield  of  the  soluble  components.

Determination of total polyphenol content (TPC)

TPC was analysed  as  previously  described  [13].  The  TPCs  of  the  samples  were  expressed  as  mg  of  gallic  acid  equivalents  per  gram  of  MSKE.

Determination of antioxidant activities

The  antioxidant  activity  of  MSKE  was  evaluated  using  four  different  methods;  the  2,  2-diphenyl-2-picrylhydrazyl  (DPPH)  radical  scavenging  assay,  the  ferric  reducing  antioxidative  power  assay  (FRAP),  the  hydrogen  peroxide  scavenging  assay  and  the  2,  2'-azino-bis  (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic   acid)  (ABTS)  radical  scavenging  assay.  The assays were  performed  according  to  previous  reports  [14].  The  results  were expressed as  mg  of  trolox  equivalents  per  gram  of  MSKE.

Determination of enzyme inhibition activity

The  tyrosinase  inhibition  activity  was  measured  using  a  modified  dopachrome  method with mushroom  tyrosinase  and  L-3,  4-dihydroxyphenylalanine  as  the  substrate  [15].  The  5-lipoxygenase  inhibition  activity  was  studied  using  sodium  linoleate  as  the  substrate  according  to  a  previous  study  [16].  The  hyaluronidase  inhibition  activity  was  determined  using  sodium  hyaluronate  as  substrate  following  a  previously  described  method  [17].  The  α-glucosidase  inhibition  activity  was  measured  using  p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside  as  substrate  [18].  All  inhibitory  effects  of  the  samples  were  expressed  as  the  inhibitor  concentration  causing  a  50 %  loss  of  enzyme  activity  (IC50).

Preparation of cosmetic cream

The  oil-in-water  emulsion  creams  used  in  this  study  were  prepared,  respectively  by  melting  the  lipophilic  phase  including  Emulium  Delta  (5.0 %),  stearic  acid  (1.5 %),  stearyl  alcohol  (2.0 %),  Captex  300  (3 %)  and  cetyl  alcohol  (1.5 %)  in  a  water  bath  at  80 °C and  separately  mixing  the  hydropholic  phase;  propylene  glycol  (3 %),  xanthan  gum  (0.1 %),  EDTA  (0.1 %)  and  water  in  a  water  bath  at  70 °C.  

The  2  phases  were  mixed  by  homogenizer  at  20,000  rpm  for  3  min  and  cooled  down  at  room  temperature.  MSKE  (0,  1,  2,  and  3 %  w/w)  and  0.1 %  phenoxyethanol  as  preservative  were  added  and  mixed  again  at  10,000  rpm  for  3  min.

Test for resistance to centrifugation  

The  resistance  to  centrifugation  study  was  based  on  a  previously  described  method  [19].  The samples  were  stored  at  ambient  temperature  and  humidity  for  48  h.  A  10  ml sample  was  centrifuged  at  3000  rpm  for  30  min.  The  Samples  were  evaluated  for  phase  separation  by  measuring  the  supernatant  after  centrifugation.

Assessment of physical stability  

The  samples  were  stored  at  -4 °C  for  24  h  and  then  25 °C  for  another  24  h  and  this  was  repeated  for  6  cycles.  Samples  were  taken  every  48  h  for  the  evaluation  of  pH,  viscosity,  phase  separation,  colour  and  TPC.  The  samples  were  centrifuged  at  15000  g  for  30  min  at  4 °C  and  the  supernatant  was  analysed  for  TPC  using  a  previously  described  method  [13].

The  colour  of  the  samples  was  expressed  as  L  (degree  of  lightness),  a  (degree  of  redness)  and  b  (degree  of  yellowness)  values.  The  total  colour  difference  (ΔE)  was  calculated  by  Eq  1.  

ΔE = √ (L – L’)² + (a - a’)² + (b – b’)²   ........ (1)

where  L,  a  and  b  are  the  sample  colours,  and  L´,  a´ and  b´  are  the  colours  at  time  zero.

Skin irritation test  

MSKE cream  was  subjected  to  in-vivo  skin  irritation  assessment.  A  total  of  20  Thai  men  and  women  with  normal  skin,  18  years  old  and  older,  volunteered  to  participate  in  this study.  Patch  tests  were  performed  on  a  part  of  the  back  (5x4 cm)  of  all  volunteers.  After  24 h,  the  patch  was  removed  and  the  skin  was  observed  for  redness/  irritation  after  30  min  and  24  h.  The  method  used  in  this  study  was  approved  by  the  Ethical  Committee  for  in  vivo  Studies  of  Mae  Fah  Luang  University,  Thailand  (reference  no.  REH-50005).

Statistical analysis

The  results  are  expressed  as  the  mean ± standard  deviation  (SD,  n = 3)  Statistical  analyses  were  carried  out  by  a  one-way  ANOVA  using  SPSS  version  16.0.  Significant differences were at p < 0.05.

Extraction yield and TPC         

The  effect  of  duration  of  ultrasonication  on  the  extraction  yield  and  TPC  of  the  MSKEs  from  the  two  cultivars  are  shown  in  table  1.  The  results  showed  that  a  longer  ultrasonication  duration  (up  to  45  min)  gave  a  significantly  higher  (p ≤ 0.05)  extraction  yield  and  TPC  of  the  extracts.  However,  the  values  were  not  significantly  different  (p > 0.05)  after  45  min,  indicating  that  the  optimum  duration  of  ultrasonication  for  the  extraction  of  MSKEs  under  the  conditions  used  in  this  experiment  was  45  min.  The  Choke-Anan  cultivar  had  a  higher  extraction  yield  and  TPC  than  the  Kaew  cultivar.  The  MSKE  obtained  by  ultrasonic-assisted  extraction  at  45  min  gave  a  55 and  63 %  higher  extraction  yield  and  92 and  55 %  higher  TPC  for  the  Kaew  and  Choke-Anan  cultivars,  respectively  compared  to  conventional  ethanol  extraction.

Antioxidant activity of MSKE

MSKEs  prepared  by  the  ultrasonication-assisted  extraction  of  the  two  cultivars  had  approximately two-fold  greater  antioxidant  activity  for  all the methods  studied  (Table  2).  The higher  polyphenol  content  in  the  MSKEs  obtained  by  ultrasonication-assisted  extraction  (Table  1)  likely  contributed  to  the  greater  antioxidant  activity.  In  addition,  the  Choke-Anan  MSKE  showed  a  higher  antioxidant  activity  than  the  Kaew  MSKE  for  all  methods  evaluated.  The results  corresponded  to  the  content  of  TPC,  which  was  also  higher  in  the  Choke-Anan  MSKE  (Table  1).

Enzyme inhibition capacity of MSKEs

As  shown  in  Table  3,  the  Kaew  and  Choke-Anan  MSKE  were  not  significantly  different  (p > 0.05)  for  the  tyrosinase  inhibitory  activity  compared  to  arbutin  and  the  IC₅₀  values  were  in  the  range  of 19.86 + 1.2  to  20.64 + 0.3  μg / mL.  The  Choke-Anan  MSKE  had  significantly  higher  (p < 0.05)  5-lipoxygenase  inhibitory  activity  than  that  the  Kaew  MSKE.  However,  the  inhibitor  concentration  that  caused  a  50 %  loss  of  the  enzyme  activity  (IC₅₀)  of  the  MSKEs  was  approximately  3.2 - 4.3  fold  higher  than  rutin.  The  hyaluronidase  inhibitory  activity  of  the  Choke-Anan  MSKE  was  not  significantly  different  (p > 0.05)  compared  to  vitamin  C.  However  the  Kaew  MSKE  showed  an  approximately  1.3  fold  lower  inhibitory  activity.  The  Choke-Anan  MSKE  had  a  significantly  higher  (p < 0.05)  α-glucosidase  inhibitory  capacity  than  the  Kaew  MSKE.  The  Choke-Anan  MSKE  had  an  approximately  1.1  fold  higher  IC₅₀  than  acarbose,  indicating  a  slightly  lower  α-glucosidase  inhibitory  activity.

Physical stability of MSKE cream

After  centrifugation,  phase  separation  was  not  observed  in  any  sample  of  MSKE  cream  or  the  control  base  (data  not  shown).  A  physical  stability  evaluation  of  the  MSKE  creams  is  shown  in  Table  4.  A  freeze-thaw  cycling  test  showed  that  the  pH  and viscosity  of  the samples  from  each cycle  did  not  exhibit  significant  changes  (p > 0.05)  and  no  phase  separation  was  observed  in  any  sample.  The  results  indicate  that  the  pH,  viscosity  and  appearance  of  the  MSKE  creams  were  stable  and  that  the  MSKE  did  not  affect  the  physical  properties  tested.  In  particular,  the  total  colour  (ΔE)  of  the  1% MSKE  and  the  base  cream  was  not  significantly  different  (p > 0.05)  for  any  cycle  (data  not  shown),  while  the  (ΔE)  of  the  2  and  3 %  MSKE  creams  were  significantly  different  (p < 0.05).

Clinical skin irritation

No volunteer exposed  to  MSKE  cream  showed  an  adverse  reaction.  Skin  exposed  to  the MSKE  cream  did  not  respond  differently  than  skin  exposed  to  the  negative  control  (data  not  shown).

This  study  found  that  the  Choke-Anan  and  Kaew  MSKEs  had  higher  extraction  yields  and  TPC  when  ultrasonication  was  applied  during  extraction.  A  higher  TPC  of  MSKE  had  previously  been  observed  when  an  ultrasonic-assisted  aqueous  two  phase  extraction  of  mango  seed  kernel  was  used  [20].  Ultrasonication  was  shown  to  disrupt  the  cell  membrane  and  the  cell  wall  structure,  increasing  solvent  diffusion  through  the  membrane,  thus  facilitating  the  release  of  the  cell  contents  [21]. 

MSKEs  from  the  two  cultivars  prepared  by  ultrasonication-assisted  extraction  showed  greater  antioxidant  activity  for  all  methods  studied  and  the  Choke-Anan  MSKE  had  higher  antioxidant  activity  than  the  Kaew  MSKE.  The  results  agree  with  reports  of  concurrent  antioxidant  activities  indicated  by  DPPH  and  ABTS  methods  for  Choke-Anan  MSKE  when  compared  to  several  other  varieties  of  Thai  mangoes  [22].  Moreover,  the  Choke-Anan  and  Kaew  MSKEs  had  the  highest  antioxidant  properties  of  eleven  mango  varieties  studied  [23].

The  results  showed  that  tyrosinase  inhibitory  activity  of  the  Kaew  and  Choke-Anan  MSKEs  were  similar  to  previously  reported  values.  Choke-Anan  MSKE  was  previously  shown  to  inhibit  tyrosinase  activity  up  to  1.58  fold  higher  than  arbutin  [25].  These  results  indicated  that  MSKE  can  be  a  good  source  of  phytochemicals  with  tyrosinase  inhibitory  activity. 

5-Lipoxygenase  catalyses  the  conversion  of  polyunsaturated  fatty  acids  to  biologically  active  metabolites,  which  are  active  mediators  in  a  variety  of  inflammation  processes    [26].  A  previous  study  showed  that  the  IC₅₀  values  for  the  5-lipoxygenase  inhibitory  activity  of  eight  plant  extracts  ranged  from  27.4 + 0.6  to  66.7 + 0.6  µg / mL  [27].  These  5-lipoxygenase  inhibition  activities  imply  that  MSKE  has  a  high  potential  for  use  as  natural  anti-inflamatory  drug  compared  to  other  plant  extracts  reported  in  previous  studies.

It  is  well  understood  that  the  degradation  of  hyaluronic  acid  by  hyaluronidase  can  diminish  amount  of  hyaluronic  acid  in  the  skin,  which  consequently  becomes  dry  and  wrinkled  [28].  An  extract  of  the  bark  of  Terminaliaarjuna  (250  µg / mL)  and  dried  fruit  rinds  of  Terminaliachebula  (500  µg / mL)  have  been  reported  to  have  90.40 + 5.30 %  and  89.65 + 3.90 %  hyaluronidase  inhibition,  respectively  [29].  In  the  present  study,  the  Kaew  and  Choke-Anan  MSKEs  respectively  gave  up  to  80.35 %  and  97.61 %  inhibition  at  concentrations  of  70 µg / mL.  These  results  indicate  that  the  MSKEs,  and  especially  Choke-Anan  MSKEs,  have  a  potential  for  cosmetic  use  as  an  anti-wrinkle  agent.

The  progression  of  diabetes  mellitus  can  be  controlled  by  inhibiting  the  absorption  of  dietary  carbohydrates  in  the  small  intestine  [30].  The  α-glucosidase  inhibitory  activity  of  the  Kaew  and  Choke-Anan  MSKEs  compared  to  acarbose  showed  IC₅₀  values  of  163.19 + 2.3,  113.51 + 5.8,  and  104.42 + 5.5  µg / mL,  respectively.  A  methanol  extract  of  mango  seed  from  Nigeria  has  been  reported  to  inhibit  α-glucosidase  with  an  IC₅₀  of  340  μg / mL  [31]. The  results  in  this  study  revealed  that  MSKEs  potently  inhibit  α-glucosidase  activity.

Due  to  the  higher  bioactivity  of  the  Choke-Anan  MSKE,  it  was  further  evaluated  for  its  potential  use  as  a  cosmetic  ingredient.  The  results  revealed  that  addition  of  MSKE  at  1 %  in  a  cosmetic  cream  caused  no  significant  difference  (p > 0.05)  of  the physicochemical properties  or  the  skin  irritation  test  result  of  the  cream.  Moreover,  adding  MSKE  to  the  cream  contributed  to  the  total  polyphenol  content  of  the  product.

The findings of this  study  indicate  that  mango  seed  by-products  can  be  used  as  a  new  ingredient  source  for  the  food,  pharmaceutical  and  cosmetic  industries. The  results  demonstrate  that  Kaew and Choke-Anan  MSKEs  exhibit  antioxidant activities  as well as  inhibit  tyrosinase,  5-lipoxygenase,  hyaluronidase  and  α-glucosidase activities. A  cosmetic  cream  containing  1 %  Choke-Anan  MSKE  is  physically  stable  and  appears  safe  for  use  on  human  skin.